高效液相色譜法是什么？

高效液相色譜法是20世紀60年代后期發展起來的一種分析方法，以經典的液相色譜為基礎，是以高壓下的液體為流動相的色譜過程。

通常所說的柱層析、薄層層析或紙層析就是經典的液相色譜。所用的固定相為大于100um的吸附劑(硅膠、氧化鋁等)。這種傳統的液相色譜所用的固定相粒度大，傳質擴散慢，因而柱效低，分離能力差，只能進行簡單混合物的分離。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、傳質快、柱效高。

高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論；在技術上，流動相改為高壓輸送(最高輸送壓力可達29.4MPa)；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜(每米塔板數可達幾萬或幾十萬)；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。

高效液相色譜的特點

? 高壓

液相色譜法以液體為流動相(稱為載液)，液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350×105Pa。

? 高速

流動相在柱內的流速較經典色譜快得多，一般可達1-10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少于1h 。

? 高效

HPLC的分離效率高于普通液相色譜，在發展過程中又出現了許多新型固定相，使分離效率大大提高。

? 高靈敏度

高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般微升。

? 適應范圍寬

氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難于應用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對于高沸點、熱穩定性差、相對分子量大(大于400以上)的有機物(這些物質幾乎占有機物總數的75%-80%)原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70%-80%。

高效液相色譜的組成

由溶劑輸送系統(脫氣機、高壓泵等)、進樣系統(定量泵、六通閥、定量環、進樣針等)、分離系統(色譜柱等)、檢測系統(檢測器等)、記錄及數據處理系統組成。

? 高壓輸液系統

將流動相在高壓下連續不斷地送入液路系統，具有足夠的壓力，輸出流量恒定、可調，輸出壓力平穩，泵室體積小，泵體抗腐蝕、耐酸等特點。

壓力平穩、流速恒定是系統穩定、重現性良好的前提條件，多數的HPLC故障、色譜數據異常均會表現出壓力異常，如偏高、偏低、波動大等，在日常使用中需特別關注壓力變化。

? 在線脫氣機

四元低壓系統屬于泵前混合，由于在常壓下混合，易產生氣泡，必須配有在線脫氣機，并要求流動相使用前進行脫氣。

流動相脫氣方法有低壓脫氣法(電磁攪拌、水泵抽空，可同時加熱或向溶劑吹氮氣)、吹氦氣脫氣法和超聲波脫氣法等。

流動相脫氣目的：

? 使色譜泵輸液均勻準確，減小脈動；

? 提高保留時間和色譜峰面積的重現性；

? 防止氣泡引起尖峰；

? 使基線穩定，提高信噪比；

? 降低溶劑的紫外吸收本底；

? 減少死體積；

? 防止填料氧化。

? 進樣系統

(1)手動進樣系統

定量環用于準確定量，分為5μl、10μl、20μl等，需要根據不同進樣量選擇合適的定量環。

(2)自動進樣系統

儀器自帶定量環多為100μl，如進樣量大于定量環體積需咨詢相應儀器工程師更換定量環及計量泵等，六通閥是理想的進樣部件，其由圓形密封墊(轉子)和固定底座(定子)組成，通過閥切換保證恒定的流速。

分析液相多數配自動進樣系統，因其具有進樣精度高、重現性好、可用于大量樣品分析等特點；也要求具有良好的密封性，小的死體積，好的穩定性，進樣時對色譜系統壓力、流量影響較小。

? 分離系統

包括色譜注、柱溫箱、連接管線等部件。

(1)色譜柱

色譜柱是實現分離的核心部件，由柱管和固定相組成。柱管為直型不銹鋼管，一般色譜柱長5-30cm，內徑4-5mm，凝膠色譜柱內徑3-12mm，而制備色譜柱內徑則可達25mm。一般淋洗溶劑在進入色譜分離柱之前，先通過前置柱。HPLC柱的填料顆粒粒徑一般約為3-10m，填充常采用勻漿法，色譜柱的發展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效，根據不同的實驗需求需要選擇不同填料、不同規格的色譜柱。

(2)柱溫箱

保證分離系統的溫度恒定，降低溫度波動對色譜基線、保留時間及色譜分離的影響，包括普通柱溫箱及帶有冷卻功能的柱溫箱，普通柱溫箱可根據方法需求設定高于室溫的溫度(一般應高于室溫5℃以上)，降低柱壓或是改善色譜分離，帶有冷卻功能的柱溫箱可以升高柱溫外，還可以設定低于室溫的溫度，預防穩定性差樣品的降解，各品牌柱溫箱的控溫范圍略有差別，需要通過相應產品說明書或咨詢了解。需注意：有些品牌的柱溫箱是沒有配置預加熱模塊的，對于溫度敏感的樣品需要在柱前連接一段管線，對流動相進行預加熱，管線長度及內徑需適當，盡量降低死體積。

? 檢測系統

用來連續監測經色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置，包括紫外可見吸收檢測器(UVD)、熒光檢測器(FD)、蒸發光檢測器(ELSD)、示差折光檢測器(RID)、電化學檢測器(ED)、化學發光檢測器(CD)、質譜檢測器(MS)等類型，其技術要求為靈敏度高、噪音低、線形范圍寬、響應快。

(1)紫外可見吸收檢測器(UVD)

波長范圍190-800mm，190-400mm為紫外區域，氘燈；400-800mm為可見光區域，鎢燈。其特點為靈敏度高，最小檢測濃度10-9g/ml，線性范圍寬，對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫，應用范圍廣。適用于帶有共軛基團的化合物，為最常用的檢測器。

(2)熒光檢測器(FD)

氘燈作激發光源，波長范圍250-600nm。其特點為靈敏度更高，檢測限10-12～10-13g/ml(靈敏度比UV檢測器高2-3個數量級)，選擇性好，對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫，所需試樣量少，適于痕量分析，應用于組分吸收一定波長紫外光后發射熒光的物質，且熒光強度與濃度成正比。

(3)蒸發光檢測器(ELSD)

一種通用型檢測器，可檢測揮發性低于流動相的任何樣品，而不需要樣品含有發色基團。蒸發光散射檢測器靈敏度比示差折光檢測器高，對溫度變化不敏感，基線穩定，適合與梯度洗脫液相色譜聯用。被廣泛應用于碳水化合物、類脂、脂肪酸和氨基酸、藥物以及聚合物等的檢測。其主要缺點為響應值與濃度不呈線性，需取響應值的對數與濃度計算線性。

(4)示差折光檢測器(RID)

一種連續檢測樣品流路與參比流路間液體折光指數差值的通用型檢測器，其優點為對糖類檢測靈敏度較高，其檢測限可達10-8g/ml；穩定性好，操作方便，缺點該檢測器對多數物質的靈敏度低(約10-5g/ml)，通常不用于痕量分析；受環境溫度、流動相組成等波動的影響大，不適合梯度洗脫。

(5)質譜檢測器(MS)

將樣品中的分析物電離，不同質量離子在電場或磁場中，將按其質量和所帶的電荷比(質荷比，m/z)進行的分離和排序，根據質荷比的大小和相對強度形成規則的質譜，從而對物質進行結構鑒別和定量分析。質譜分析具有靈敏度高，樣品用量少，分析速度快，分離和鑒定同時進行等優點，但流動相中不能含有無機鹽。

氣相色譜法的核心知識點

? 高效液相色譜法對流動相的要求

流動相不與色譜柱發生不可逆化學變化，以保持柱效或柱子的保留性質較長時間不變；對待測樣品有足夠的溶解能力，與所用檢測器相匹配；粘度盡可能小，以獲得較高的柱效；流動相純度要高，價格便宜，毒性小。

? 高效液相色譜法按固定相承受壓力分類

(1)剛性固體

以二氧化硅為基質，可承受較高壓力，表面可鍵合各種功能官能團——鍵合固定相，是目前應用廣泛的固定相。

(2)硬膠

主要用于離子交換色譜法和凝膠色譜法中，由聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯而成，可承受的壓力較低。按孔隙深度分：

①表面多孔型

基體是球形玻璃珠，在玻璃表面涂覆一層多孔活性物質如硅膠、氧化鋁、聚酰胺、離子交換樹脂、分子篩等。適用于快速分離、填充均勻緊密、機械強度高、能承受高壓，適于簡單的樣品及常規分析；缺點是多孔層薄，進樣量受限制。

②全多孔型

由硅膠顆粒聚集而成，比表面積大，柱容量大，小顆粒全孔型固定相孔洞淺傳質速率快，柱效高，分離效果好，適合于復雜樣品、痕量組分的分離分析，是目前HPLC中應用廣泛的固定相。

? 液固吸附色譜法原理

以固體吸附劑為固定相，吸附劑表面的活性中心具有吸附能力，試樣分子被流動相帶入柱內時，它將與流動相溶劑分子在吸附劑表面發生競爭吸附。分離過程是一個吸附-解吸的平衡過程。

? 液固吸附色譜法固定相

通常是硅膠、氧化鋁、活性炭等固體吸附劑，硅膠最常用；流動相：極性大的試樣需用極性強的洗脫劑，極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。應用：幾何異構體分離和族分離，如農藥異構體；石油中烷、烯、芳烴的分離。不適于強極性的離子型樣品的分離，不適于分離同系物(因為，它對相對分子質量的選擇性較小)。

? 液液分配色譜法原理

根據物質在兩種互不相溶(或部分互溶)的液體中溶解度的不同實現分離，分配系數較大的組分保留值也較大。

? 液液分配色譜法流動相

流動相與固定液應盡量不互溶，或者二者的極性相差越大越好。根據流動相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜(流動相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于強極性和中等極性組分分離)和反相分配色譜(流動相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性或弱極性組分分離)。固定相：由載體和固定液組成。常用的固定液有b，b’-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、角鯊烷等。應用：同系物組分的分離。例如分離水解蛋白質所生成的各種氨基酸，分離脂肪酸同系物等。

? 化學鍵合固定相

化學鍵合固定相是利用化學反應將有機分子鍵合到載體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而構成各種性能的固定相。

? 化學鍵合固定相的特點

固定相不易流失，柱的穩定性和壽命較高；能耐受各種溶劑，可用于梯度洗脫；表面較為均一。沒有液坑，傳質快，柱效高；能鍵合不同基團以改變其選擇性。例如鍵合氰基、氨基等極性集團用于正相色譜法，鍵合離子交換基團用于離子色譜法，鍵合C2、C4、C6、C8、C18、C16、C18、C22烷基和苯基等非極性基團用于反相色譜法等。因此它是HPLC較為理想的固定相。

? 離子交換色譜法原理

離子交換色譜法的固定相是離子交換樹脂，流動相是水溶液，它是利用待測樣品中各組分離子與離子交換樹脂的親和力的不同而進行分離的。

? 離子交換色譜法流動相

水的緩沖溶液，陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；應用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。

? 凝膠色譜法原理

凝膠色譜法的固定相為多孔性凝膠類物質，流動相為水溶液或有機溶劑，它是根據不同組分分子體積的大小進行分離的。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對相對分子質量在100-105范圍內的化合物按質量分離。

? 凝膠色譜法流動相

能溶解樣品且與凝膠相似(潤濕凝膠并防止吸附作用)、粘度小(增加擴散速度)。常用四氫呋喃、苯、氯仿、水等。

? 影響分離的因素與提高柱效的途徑

(1)液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍左右，故降低傳質阻力是提高柱效主要途徑；

(2)由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效；

(3)液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質；

(4)恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素；

(5)流速大于0.5cm/s時，H-u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調整分離度和出峰時間的重要可選擇參數；

(6)氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般很少自行制備。